Cellule staminali: crescono meglio se il supporto è microstampato

Immagine al microscopio elettronico di una cellula del cervello generata da una cellula staminale pluripotente. L’esperimento è stato condotto da Su-Chun Zhang nel laboratorio dell’università Wisconsin-Madison
Immagine al microscopio elettronico di una cellula del cervello generata da una cellula staminale pluripotente. L’esperimento è stato condotto da Su-Chun Zhang nel laboratorio dell’università Wisconsin-Madison

La superficie del substrato di crescita influenza in modo determinante la differenziazione delle cellule staminali. L’accuratezza ottenibile con il microstampaggio risolve il problema

La ricerca nel campo delle cellule staminali sta facendo passi da gigante, esplorando sia le possibilità di impiego terapeutico sia le tecniche legate alla crescita delle cellule e dei tessuti funzionali. La letteratura scientifica dedicata a quest’ultimo argomento, oggi particolarmente corposa, dimostra che le superfici micro e nano strutturate hanno la capacità di suscitare stimoli specifici e di favorire la differenziazione controllata delle cellule staminali in vitro.

In questo ambito si inserisce il progetto NanoBones, finanziato dal Dipartimento della Sanità pubblica e dell’Innovazione del Ministero della Salute e sviluppato dal Laboratorio di Tecnologie e Sistemi di Lavorazione (Te.Si.) del dipartimento di Ingegneria Industriale (DII) dell’Università di Padova e dall’Ospedale San Luca di Trecenta (ULSS 18). Scopo della ricerca è la realizzazione di materiali osteoinduttivi (capaci cioè di stimolare la differenziazione delle cellule staminali in osteoblasti, che a loro volta elaborano il tessuto osseo, NdR) tramite la modifica della superficie di materiali polimerici già impiegati nella sostituzione ossea.

L’utilizzo delle plastiche per applicazioni di largo consumo può offrire numerosi vantaggi rispetto ad altre tipologie di materiali, poiché possono essere lavorabili a costi piuttosto contenuti e richiedono tecnologie che offrono un’elevata ripetibilità nella produzione di massa. Per la realizzazione di componenti microstrutturati in materiale polimerico si possono impiegare diverse tecniche di microformatura; tra queste il microstampaggio a iniezione offre il miglior compromesso tra precisione e capacità di produzione di massa a basso costo unitario. Tra gli altri vantaggi ricordiamo il breve tempo ciclo, la possibilità di automatizzare completamente il processo e la disponibilità di un considerevole know-how trasferibile dal processo di stampaggio a iniezione convenzionale. Tuttavia, il problema principale posto dal processo di microstampaggio in questo comparto riguarda l’accuratezza nella replicazione delle microfeatures.

1 Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali in cellule mature (Fonte Terese Winslow)
1 Differenziazione delle cellule staminali mesenchimali in cellule mature (Fonte Terese Winslow)

L’influenza dei parametri di processo nel microstampaggio

Il processo di microstampaggio a iniezione per la realizzazione di componenti microstrutturati è influenzato da numerosi parametri di processo. I principali sono la tipologia di materiale utilizzato, la temperatura del fuso, la temperatura degli stampi, la velocità di iniezione, la pressione di mantenimento e l’utilizzo del vuoto. Questi parametri influiscono sulla capacità di realizzare le geometrie desiderate, in particolare sul raggiungimento del riempimento completo della cavità, e sulle qualità delle geometrie realizzate.

Nel microstampaggio a iniezione l’altezza delle microfeatures poste sulla superficie dell’inserto sono approssimativamente tre ordini di grandezza inferiori rispetto alle dimensioni dello stampaggio tradizionale. Un polimero che fluisce all’interno di un canale di spessore (h) con velocità media (vm) possiede uno strain rate medio (gm) e uno shear stress (t) pari a:

equazione_1

con (h) viscosità del polimero, funzione della temperatura. Questa equazione rivela come lo shear strain nel microstampaggio a iniezione sia migliaia di volte maggiore rispetto a quello dello stampaggio tradizionale per raggiungere la stessa velocità di riempimento del polimero.

Nel microstampaggio risulta pertanto essenziale ridurre la viscosità del polimero scegliendo un materiale a elevata fluidità e mantenendo elevate temperature dello stampo e del fuso [3]. Nel caso in esame sì è scelto un polistirene a bassa viscosità, in quanto biocompatibile approvato dalla U.S. Food and Drug Administration e ampiamente utilizzato come mezzo di coltura cellulare.

Nel processo di microstampaggio a iniezione di geometrie microstrutturate poste al di sopra di un substrato si possono distinguere due meccanismi principali: una prima fase di riempimento della cavità principale e una seconda fase di impaccamento e riempimento delle microstrutture [4]. Il materiale fuso ad alta temperatura fluisce inizialmente nelle cavità in cui incontra una minore resistenza allo scorrimento, cioè nelle sezioni trasversali caratterizzate da un’area maggiore, e ristagna invece all’entrata delle microstrutture caratterizzate da una sezione trasversale di diversi ordini di grandezza inferiore rispetto alla cavità principale [6]. Il polimero fuso, entrando in contatto con gli stampi a bassa temperatura, inizia a solidificare formando una pelle superficiale; qualora il tempo di riempimento necessario al riempimento della cavità sia superiore al tempo di raffreddamento e solidificazione del polimero si ha la comparsa dell’effetto di esitazione, cioè la pelle solida formatasi sulla superficie del polimero si oppone e impedisce il riempimento delle cavità, anche qualora vengano applicate elevate pressioni di mantenimento [2].

Al fine di diminuire la comparsa dell’effetto di esitazione, in letteratura sono state proposte diverse soluzioni: progettare pezzi con substrati di spessore superiore a 2 millimetri in modo da aumentare l’effetto della pressione di impaccamento; aumentare la temperatura dello stampo per diminuire il gradiente termico tra stampo e polimero fuso; aumentare la velocità di iniezione per diminuire il tempo di contatto tra polimero e superficie dello stampo prima dell’inizio della fase di riempimento.

Al fine di facilitare il completo riempimento della cavità, e quindi la replicazione delle microfeatures, si rende utile l’utilizzo di un sistema dedicato per l’evacuazione forzata dell’aria all’interno della cavità dello stampo. L’impiego dell’evacuazione, tuttavia, non è sempre sufficiente a evitare la formazione di aria intrappolata, e può invece causare una diminuzione della temperatura sulla superficie dello stampo rimuovendo continuamente l’aria calda presente. Quest’effetto è particolarmente importante per i polimeri sensibili alla temperatura dello stampo. In questi casi, infatti, si è notato un lieve calo delle capacità del polimero di replicare la superficie desiderata e una conseguente riduzione dell’influenza della temperatura sulla replicazione desiderata.

Al fine di studiare la dipendenza del grado di replicazione delle microfeatures dai parametri di processo, il Laboratorio Te.Si. ha effettuato una campagna sperimentale utilizzando tecnologie allo stato dell’arte.

Progetto delle microfeatures e realizzazione dello stampo

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) si differenziano in cellule mature in base all’interazione tra la cellula e il substrato (figura 2).

2 Dipendenza della differenziazione cellulare dall’elasticità del substrato (E)
2 Dipendenza della differenziazione cellulare dall’elasticità del substrato (E)

In particolare, la differenziazione dipende fortemente dalla rigidezza del substrato [1]. Nel progetto si è deciso di lavorare con topografie costituite da micropillars di forma cilindrica con rigidezze diverse (figura 3), in modo da individuare la configurazione che consentisse la differenziazione delle MSC in osteoblasti. Per modificare la rigidezza dei pattern sono stati variati diametro e interasse tra i micropillars (vedi tabella).

3 Micropattern realizzato sulla superficie della cavità dello stampo
3 Micropattern realizzato sulla superficie della cavità dello stampo

 

Dimensioni nominali dei micro pattern

InsertoDiametro (micron)Interasse (micron)Profondità… (micron)Rapporto d'aspetto
D2IA8280,50,25
D3IA9390,750,25
D4IA1041010,25

Lo stampo è stato realizzato in acciaio, con criteri e tecnologie convenzionali a eccezione delle microfeatures, per le quali si sono utilizzate tecniche litografiche su resist Hybrid Sol-Gel. Si tratta di una nuova classe di materiali dielettrici utilizzata in applicazioni fotoniche; questi materiali combinano le proprietà dei polimeri (per esempio, eccellente stampabilità) alle proprietà tipiche dei materiali vetrosi (per esempio, stabilità chimica, durezza e trasparenza ai raggi UV). Molto interessante è la loro versatilità: infatti, è possibile aggiustare le loro proprietà incorporando ossidi di metallo (Ge, Ti, Zr, Al…) nella matrice principale a base silicea. Tali materiali innovativi sono stati sviluppati all’interno del DII.

Replicazione delle microfeatures mediante microstampaggio

Le prove di stampaggio sono state condotte nel Laboratorio Te.Si. impiegando una macchina a iniezione per microstampaggio MicroPower 15 di Wittmann Battenfeld. Per l’ottimizzazione del processo è stato seguito un approccio del tipo Design Of Experimets (DOE), variando la velocità di iniezione, la temperatura dello stampo e la pressione di impaccamento.

Dall’analisi della varianza, la temperatura dello stampo è risultato il fattore più significativo tra quelli studiati. Un aumento di questo fattore migliora la fluidità del polimero fuso iniettato all’interno della cavità e causa un aumento del tempo necessario alla formazione della pelle superficiale. Questi due processi concorrono entrambi a un sensibile miglioramento del riempimento dei micropillars. Per quanto riguarda la pressione di impaccamento, l’andamento rilevato, risulta poco influente a causa delle ridotte temperature dello stampo utilizzate. Anche con l’applicazione di elevate pressioni di mantenimento, il riempimento dei micropillars risulta difficoltoso a causa della formazione dell’effetto pelle. La rapida solidificazione del polimero a contatto con gli stampi si oppone infatti al riempimento, anche qualora vengano applicate pressioni elevate. Dalle prove è emerso inoltre che il riempimento per temperature inferiori alla transizione vetrosa è una funzione della pressione di iniezione, e quindi della velocità di iniezione secondo il processo descritto precedentemente, e che il riempimento in funzione della pressione di mantenimento è meno significativo.

Caratterizzazione dimensionale dei componenti stampati

L’accuratezza di replicazione delle microfeatures è stata valutata dai ricercatori del Laboratorio Te.Si. In particolare, per verificare le dimensioni principali delle microfeatures e confrontare i componenti stampati con la geometria dello stampo, è stato utilizzato un microscopio confocale Sensofar PLu neox.

I principali vantaggi nell’impiego della profilometria ottica consistono nell’elevata velocità di scansione, che dipende esclusivamente dalla velocità di riflessione della luce e di elaborazione dei dati, e nell’acquisizione non a contatto, che non danneggia il pezzo e non necessita di ancorare saldamente il campione analizzato allo strumento. Il principio base della profilometria a confocale consiste nel registrare una sequenza di immagini confocali ottenute a differenti piani lungo l’asse z; l’analisi dell’unione di queste immagini permette di ricostruire la superficie tridimensionale e di ottenere le relative misurazioni topografiche. Tutte le misurazioni sono state eseguite utilizzando un obbiettivo 100x acquisendo una finestra pari a 127, 33×95, 45 µm2 (figura 4).

4 Scansione al microscopio confocale
4 Scansione al microscopio confocale

Cultura cellulare in vitro

La coltura cellulare è stata effettuata presso il Dipartimento di Scienze Farmaceutiche di Padova. Le MSC sono state seminate in piastre a 96 pozzetti contenenti i supporti modificati con i micropillars. Come controllo, sono stati utilizzati supporti di polistirene non modificati in superficie. Dopo 24, 48 e 96 ore dalla semina, sono stati eseguiti i saggi di vitalità cellulare e le colture sono state osservate al microscopio elettronico a scansione.

Come si può osservare nella figura 5, a 48 ore dalla semina le cellule appaiono ben adese su tutte le superfici. Tuttavia, sui supporti non modificati, le MSC presentano vacuoli, probabilmente a contenuto lipidico che indicano una possibile differenziazione in senso adipocitario. Al contrario dei supporti 2-8 e 4-10, il numero di cellule presenti sul supporto 3-9 non è significativamente diverso da quelli determinati sui supporti non modificati e sui pozzetti della piastra di coltura (figura 5).

5 Microscopia elettronica a scansione (SEM) di colture di cellule staminali mesenchimali su polistirene non modificato (A, B), supporti 3-9 (C, D) e 4-10 (E, F) a 48 h dalla semina
5 Microscopia elettronica a scansione (SEM) di colture di cellule staminali mesenchimali su polistirene non modificato (A, B), supporti 3-9 (C, D) e 4-10 (E, F) a 48 h dalla semina

A 4 giorni dalla semina, tutte le colture raggiungono la confluenza. Sono tuttavia evidenti delle differenze tra colture di controllo e quelle su micropillars. Infatti, nelle prime le cellule stratificano e appaiono di piccole dimensioni con nucleo prominente, indice di un’intensa attività proliferativa, mentre nelle seconde le MSC si dispongono a formare un mostrato sottile e presentano dimensioni maggiori. I risultati dei saggi di crescita evidenziano un aumento progressivo del numero di cellule nelle colture seminate su pozzetto e su supporti non modificati. Al contrario, e in particolare sul supporto 3-9, il numero di MSC si mantiene pressoché costante dai 4 ai 28 giorni. Quest’ultima osservazione suggerisce che le cellule coltivate su superfici con micropillars siano indirizzate verso la differenziazione.

Al momento, sono in corso esperimenti su colture a 3/4 settimane per determinare l’attività della fosfatasi alcalina e il grado di mineralizzazione.

Bibliografia

1 A.J. Engler, S. Sen, H.L. Sweeney, D.E. Discher “Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification” Cell 126, 677-689, 2006
2 C. Gronik “Injection Moulding of Parts with Microstructured Surfaces” Macromolecular Symposia, 365-374, 2004
3 G. Lucchetta, M. Fiorotto, P.F. Bariani “Influence of rapid mold temperature variation on surface topography replication and appearance of injection-molded parts” CIRP Annals – Manufacturing Technology, 61/1:539-542, 2012
4 G. Tosello, A. Gava, H.N. Hansen, G. Lucchetta “Study of process parameters effect on the filling phase of micro-injection moulding using weld lines as flow markers” International Journal of Advanced Manufacturing Technology, 47/1-4:81-97, 2010
5 G. Xu, L. Yu, J.L. Lee, K.W. Koelling “Experimental and numerical studies of injection molding with microfeatures” Polymer Engineering and Science, 45/6:866-875, 2005
6 A. Liou, R. Chen “Injection molding of polymer micro and sub-micron structures with high-aspect ratios” International Journal of Advanced Manufacturing Technology, 28:1097-103, 2006

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